Изобретение относится к области электрохимических методов анализа, в частности к определению содержания свободного холестерина в образце сыворотки или плазмы крови с использованием платинового электрода и растворенного в апротонном растворителе катализатора электрохимического окисления холестерина. Способ определения холестерина в плазме или сыворотке крови включает инкубацию наночастиц, покрытых полимерами с молекулярными отпечатками (ПМО) холестерина, с исследуемой пробой, селективную сорбцию холестерина на ПМО, десорбцию холестерина из ПМО в органический апротонный растворитель, электрохимическое окисление холестерина с использованием электрокатализатора на поверхности электрода и измерение тока окисления катализатора при наложении на рабочий электрод потенциала в отсутствие и в присутствии холестерина, при этом в качестве электрокатализатора используют хлорид кобальта (II), или хлорид никеля (II), или тиоцианат калия, растворенный в ацетонитриле или диметилформамиде.